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染色质免疫共沉淀(ChI P)尝试流程与要害因素@钟鼎生物

发布日期:2021-03-31 15:03浏览次数:

染色质免疫共沉淀技能(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是一种检测在体内自然染色质情况下卵白和DNA彼此浸染的有效要领。这种技能遍及应用于检测特定基因调理卵白团结在基因组中的详细位置可能基因调理区域和卵白的修饰是否相关。日益成为研究真核细胞中转录调控环境的重要东西。本文将会先容ChIP的道理和尝试流程以及尝试乐成的要害因素。

染色质免疫共沉淀尝试流程

1.染色质免疫共沉淀尝试流程

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1.1.甲醛交联细胞

(1)细胞在100mm造就皿上发展到80% ~90%。当第一次利用细胞系做尝试时,别的造就两个造就皿,一个用于预测细胞数量,别的一个用于优化超声条件。
(2)去除上清造就液,插手lOmL 1xPBS含有终浓度为1%甲醛(插手270μL 37%甲醛到10 mL PBS)牢靠交联细胞,轻柔殽杂后置于室温10 ~20 min。
(3)插手1 mL 1.25mol/L甘氨酸(终浓度为0.125 mol/L)终止交联回响,甘氨酸终止甲醛的牢靠浸染是通过提供过量的氨基团与甲醛团结。继承放在室温5 min。
留意:从这一步开始,把所有对象放在冰上可能4℃,包罗离心步调。
(4)吸取走上清液后,用10 mL预冷1xPBS洗两遍后,以去除残留的甲醛。
(5)插手4 ~5mL预冷1xPBS,能足够包围造就皿的外貌,再用细胞刮棒刮落细胞, 转移到50 ml锥形离心管,再用4~5 mL预冷1 xPBS冲洗造就皿以收集残留的细胞。
(6)4000 rpm 离心 5 min (4℃)。
(7)去除上清,用1 mL预冷1xPBS (新鲜插手1xPIC 1O μL)悬浮细胞后,转移到1.5 mL离心管。
(8)4000 rpm 离心5 min (4℃)获得细胞沉淀,去除上清(细胞沉淀可放于 -80 ℃冰箱生存)。

1.2.染色质超声断裂

(1) 插手1 mLSDS裂解溶液重悬沉淀(新鲜插手1 X PIC 1O μl,在冰上安排10 min,每隔1 min颠倒摇动离心管。SDS能裂解细胞膜和核膜,使牢靠染色质释放出来, 这样有利于超声。
(2) 用超声细胞毁坏机把DNA打坏为长度在200 ~ 1000 bp,把样品放在冰上操纵。差异细胞样本都得举办超声条件优化尝试。
(3) 在超声后,14000 rpm 离心 10 min(4℃),转移超声染色质液体上清到1.5 ml 离心管。上清液可放于-80℃冰箱生存。

1.3.免疫沉淀卵白和DNA复合物

(1)利用ChIP稀释溶液把超声染色质液体稀释10倍,这样有利于免疫沉淀回响。 譬喻200 μL超声染色质液体插手1800 μL ChIP稀释溶液(新鲜插手1 x PIC 20 μL)。
(2)为了淘汰非特异性团结卵白配景,往2 mL超声稀释液中插手20 μL卵白A/G琼脂糖珠(Protein A/G Agarose Beads),在4℃摇床轻柔摇动1 h。
(3)1000 rpm离心2 min (4℃),转移上清液到新的离心管,插手1〜4叫免疫沉淀抗体(每种抗体插手的量都差异)到上清液中,在4℃摇床轻柔摇动留宿。别的取 50 μL上清液,不插手抗体,作为阴性比较,以验证检测的特性。

1.4.收获免疫复合物(抗体-卵白质-DNA)

(1) 40 μL Protein A/G Agarose Beads 先用 1 mL 1 x PBS 洗 3 遍,每次洗后 1 000 rpm 离心1 min,小心吸除上清,留意不要吸走Beads。最后加40 μL 1XPBS悬浮Beads。
(2)打开样品的管盖,插手40 μL Protein A/G Agarose Beads。在摇床上面摇动1~2 h,4℃,以形成抗体-卵白A免疫复合物。
(3)1000 rpm离心5min,4℃。去除上清,留意不要吸走Beads。
(4)清洗Beads:免疫沉淀复合物依次用以下所列的缓冲液洗(每个1 mL)。每次洗时,使样品在摇床上面10min,4℃,然后再4000 rpm离心5 min。吸取上清时要留意不要吸走beads。
a.低盐洗脱溶液1 mL洗一次;
b.高盐洗脱溶液1 mL洗一次;
c.氯化锂洗脱溶液1 mL洗一次;
d.TE溶液(pH 8.0) 1 mL洗两次。

1.5.洗脱免疫复合物

留意:从这一步开始,所有操纵都在室温举办。

(1)插手200 μL ChIP洗脱溶液洗脱Beads,放在摇床上室温摇动10 min。12000 rpm,离心1 min,把上清转移到新的1.5 mL离心管。
(2)再插手200 μL ChIP洗脱溶液洗脱Beads,放在摇床上室温摇动10 min,一共洗脱3次,获得600 μL洗脱液。洗脱液中含有目标卵白以及其团结的相关DNA。

1.6.去除甲醛交联

(1)插手 24μL 5mol/L NaCl 到 600μL 样品中(NaCl 终浓度为 0.2mol/L),包罗 上述1.3中的50 μL阴性比较(插手350μL ChIP洗脱溶液和16 μL 5mol/L NaCl)。
(2)65℃,留宿去除甲醛交联。甲醛可以或许在有盐离子和去污剂的高温情况下清除交联回响,使得卵白质和DNA疏散。

1.7.DNA 纯化

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