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卵白纯化ag直营平台履历指南

发布日期:2021-03-25 15:41浏览次数:

卵白纯化履历指南

生物谷整理
 
原创:Chromatography weixingui@263.net,
推荐书籍:《卵白纯化与尝试判断指南》、《生物工程下游技能》、《酶工程》、《酶制剂家产》

1) 我此刻手头有个融合卵白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用卵白酶切割后却发明目标卵白没有活性。
请问有哪些大概会呈现这种原因?怎么办理?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合卵白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有50~60%阁下。洗脱完融合卵白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目标卵白会沉淀,我用0.5%CHAPS助溶可委曲溶解部门,目标卵白疏水性较量强。

既然是疏水性很强你可以加点甘油可能乙二醇低落极性,这样溶解就会好得多,另外你也直接加2%的PEG这样也低落极性,同时掩护你的卵白,你再做纯化就可以了,我以前碰着这样的卵白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000,这样的环境下卵白照旧活性接纳率很高,我以为那些外貌活性剂能不消照旧不消的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底那边失去了活性,这样更容易办理你的问题。尚有留意缓冲液PH值,看看改变它对溶解度有没有影响。卵白有沉淀那你可以稍微把卵白的浓度低落点,这也是个步伐。

2) 请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶?

亲和的填料合成过20来种,你是但愿用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有生动的氨基好偶联,况且它们险些是同一个辅酶,你是不是思量把FAD连上去.虽然FMN的布局上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或此外活化的介质都不大好,因此我以为这个没有什么问题.
另外假如是以FMN为辅酶的,那我还可以发起 你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的布局和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.假如它可以你就不需要合成填料了,有现成的.

我已经给你发了相关一些偶联的质料,请查收,此刻一般要本身合完婚和填料,有许多公司都提供活化好的介质,本身偶联就可以,个中较量常用的有溴化氰琼脂糖凝胶,环氧琼脂糖凝胶,氨基琼脂糖凝胶,羧基琼脂糖凝胶,活化酯琼脂糖凝胶,以及巯基琼脂糖凝胶等,可是假如是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好,另外也曾经有文献报导牢靠辅酶时,偶联位置差异,选择性有不同,因此你可以选择本身适合的活化介质。
差异的活化的介质对偶联的配基有差异的要求,所以要对本身的配基相识较量清楚就可以选择符合的活化介质。

我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶,它能应用的范畴广氨基巯基羟基都可以,并且合成的介质刚性好,非特异吸附少,所以不需要非凡处理惩罚未回响基团。另外键合的键很不变,配基脱落少。我以为是不错的选择。

包容体的卵白复性做得不多,可是我记得有个哥们说最管用的步伐也是最简朴的要领,他说在复性的时候只管别想什么太高难的技能,那些时髦但不必然好用,常用的有透析复性,稀释复性,包罗海外的专家也这么说.我以为有时候开始摸不出来未必就是要领不可,要害要常常改变条件.
层析复性很时髦,可是真正能用的不许多,我以为卵白这对象难就在于大多都不沟通,所以要害要多看文献,多琢磨本身卵白的特性,多实验。

3) Sephadex G-25(medium)柱脱盐时,盐浓度太高对柱效有影响吗?若有,一般对盐浓度限度如何?

各人别客套,除盐对付浓度应该也是有必然的限制的,同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些,相对需要的柱子的判别率也要高点,可是在正常的范畴如1-2M应该影响不大,不外要除得很清洁照旧只管少上点样品,我以为上样的体积究竟比浓度的影响更大。

4) 我的卵白17kd阁下,能跟肝素亲和,ag直营网,一般用离子互换和亲和层析纯化,
此刻我用聚乙二醇修饰它 ,分子量增加5000阁下,修饰率不行能到达100%,请问修饰后能用什么纯化要领可以把修饰的和未经修饰的分隔?(虽然修饰后还残留有聚乙二醇,这个小分子也要除去)
他们大多用凝胶过滤,我以为这也不错的做法,究竟PEG是链状的分子,在柱子上和普通卵白行为纷歧样,修饰度越高那么出峰也越后,因此你的卵白选择sephadex G50试试,它的范畴在1000-30000,应该是不错的选择。另外PEG是个疏水性的链,修饰后的卵白疏水性加强,修饰度越高,疏水性越强,可以用这个道理疏散。离子互换也可以选择,因为同样原理,修饰度越高,电荷被屏蔽也越多,电荷也越少,因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子互换一样的原理,你可以试试,你手头的亲和能不能分隔,你在这几个要领里选择看哪个更经济好用就可以。

5) 我是个新手,感谢楼主给我办理了很多灾题。
我有个问题笼罩好久,从细菌中提取酶,好象用通例的要领(超声波破壁,缓冲液提取),老是拿不到我要的卵白。是不是这种卵白也是疏岁水性较强,需要加助溶剂才气提取出来?别的,我是不是也可以加点甘油可能PEG来提取?
其实这个问题我以为是这样的,既然你是提取那必定是有沉淀和上清,你的方针卵白的分子量你是应该知道的,那么跑电泳先看它到底是在上清照旧沉淀里,剩下的问题你再办理如何提取。
对付差异的酶要看酶不变如何,你可以用差异的PH去提取,我曾经提取一个酶用水就是提取不出来,需要用盐才气提取出来,多试试,设计个方案,这样才气办理问题,所以不必然加甘油就管用,你还得留意破碎自己会不会有问题,倒归去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继承探讨。

6) HPLC是用来阐明检测or疏散纯化?
假如可以用来纯化,上样量那么小有什么意义呢?
假如是用来阐明检测,奈何指导今后的疏散纯化事情呢?
HPLC既可以做阐明也可以做制备,纯化上样量小,这样疏散结果好,就大概获得很纯的物质,同时共同质谱等就何故获得许多单一卵白的特性包罗序列等,这些纯度高的组分是用一般的纯化要领做不到的。HPLC重现性好,定量精确,所以也可以用于定量和定性,是阐明中不行缺少的东西.
阐明出来后假如这个物质很不变,直接线性放大就可以做大局限的制备,因此摸好了阐明的条件也就相应有了制备的条件。
7) 操作蔬水性质,用反向HPLC要领疏散的道理?(包罗洗脱液的选择和谁先被洗脱下来等),请chromatography兄具体点。
反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的,极性越强先出来,极性越弱越后出,洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱,反像是极性强的活动相吸附,低落它的极性洗脱,选择主要是依据填料的特点以及样品自己的特点而改变的。
疏水的填料疏水团体密度只是反相的10%阁下,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的外貌全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,卵白一般稳定性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以卵白接纳率高,而反相适合做阐明多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的接纳率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.
疏水色谱是纯化卵白的另一个有力的东西.

8) 求助,我有一段小分子量的卵白,5KD阁下,4对二硫键,诱导表达后以包容体形式存在,请问,我怎么设计我的纯化步调?我用过离子互换柱,纯度可以到达60%,可是不知道下边该怎么做?望见教!
这是我的电泳图谱,第8条泳带的最下边就是我的目标卵白带,我需要复性,这是一段杀菌卵白,我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体,BL21表达
你好,我做复性不多,你可以依据有关有多对4对二硫键的卵白复性的道理看这方面的文献,我看一般有不罕用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的,尚有用分子朋侪,你可以多看看再实验:)
至于纯化,假如你的卵白有游离的巯基,那我以为很时候用以前的共价层析,专门对付巯基举办纯化,那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道此刻尚有没有这个填料,你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我,我可以把这个质料发给你,假如没有,那你只好用离子互换,凝胶过滤,你的既然抗菌,你知道是什么道理,浸染于什么部位,和什么团结,那也许可以用亲和的要领,我以为以前说抗生素有的需要疏水布局,你也可以用疏水试试。同时是包容你可以先把包容体溶解,然后低落变性剂的浓度,这样雷同分级沉淀,你就可以获得很纯的包容体,再纯化就容易了,总之我发起你先分级沉淀包容体,再做纯化。这样省事点。

9) 我胗靡桓龆屉模?肽)作配基亲和纯化一个可与它特异性团结的卵白(67kda),用什么填料较量好,您有什么好的见意?感谢
对付小分子的配基我以为需要有必然的亲和手臂,不然由于位阻很难有很好的疏散结果,说到活化填料的选择我多说几句,大多人城市选择溴化氰,可是这样做的介质一般杂吸附多,另外没有亲和手臂,所以对付小分子的配基有时候纯化结果欠好,另外自己对介质也没有交联浸染,所以刚性也差,假如常常用极度pH洗脱配基脱落也多,这是它的一些缺点。

环氧活化的琼脂糖凝胶可以有许多的手臂选择,刚性也好,没有非特异吸附,形成的键比此外活化要领更不变,因此合成的亲和介质机能更精彩,你可以选择这样的要领,偶联很简朴,你pM你的邮件给我,我可以把一些质料发给你,供你参考。

10) 我今朝作的一个卵白药物的分子量约莫是7000, 等电点4,今朝要去除内毒素有何简朴可行的要领?(此卵白已经纯化好,但检讨内毒素不外关)

你用过度子筛吗?superdexG75对你这种卵白较量符合。做之前请先用1MNaOH 1ml/min均衡2小时。这种要领除内毒素,很是有效。
假如问题请与我接洽。myhok@sina.com,我们以前去除都是用去内毒素亲和的填料直接加到样品中震荡40小时阁下,就可以,可以做到<10EU/mg

11) 请问HPLC是在卵白复性后做较量好,照旧在HPLC之后再来复性???
复性做得不多,柱上的复性更少,可是就感受而言照旧只管在柱后复性,因为这样好放大,并且容易操纵,对付HPLC的柱子很容易因为沉淀而堵柱子,包罗很高的变性剂对呆板也欠好,也大概因为流速慢而结晶堵住管道等,很巨大,固然有一些这样的例子,可是我以为真正操纵照旧贫苦,况且这样做的量也不大.所以照旧选择纯化后复性吧.

12) 我想问问:我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗,用什么团结缓冲液和洗脱缓冲液好?
我此刻拟的是:
Binding Buffer:
20mM Tris,1M NaCl,pH 8.0
Elution Buffer:
50mM 柠檬酸,pH 3.0
应该没有问题,假如挂得欠好,你可以把Binding Buffer中的1M NaCl去掉,不知道你用什么活化的载体,假如是CNBr,那就得加,可是我们发明有时候盐也可以洗脱下来对象,你试试再说吧.
洗脱你可以用pH 5.0 4.0 3都试试,假如在高一点就可以洗下来,没有须要用太低的,怕对活性有影响

13) 这段在用离子互换柱纯化卵白,我想问一下,洗脱回收的离子强度的巨细范畴,应该如何确定,可以按照什么来调解洗脱时的离子强度
一般回收的盐浓度的范畴在0-2MNaCl之间,怎么确定得共同你的洗脱的峰的电泳功效来确定,最直接的就是你的方针卵白,假如在很早就出来,那你洗脱的盐浓度(离子强度)就不消太大,假如出来的很晚或一直没有出来,那就选择更高的盐浓度。
虽然你也可以选择用阶段洗脱的要领,这样较量容易放大,疏散结果其实也不错,固然探索要贫苦点,可是重现性好,也一样可以做得很纯,并且能很准确知道在几多浓度下洗脱出来。我较量喜欢用这种洗脱要领

14) 你好:我有一个狐疑了好长时间的问题,想请教。我的卵白是2KD,在做非还原电泳时,发明除了目标卵白外,有二聚体和多聚体存在。目标卵白占44%,余下大部门为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时,只呈现两个峰,第一主峰占90%(目标卵白的位置),出峰时间为13分钟,第二主峰占10%,出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时,二聚体和多聚体是否产生改变?用此要领测定含有二聚体和多聚体存在的目标卵白纯度,是否不当?我用柱子是C4柱,5υm,300埃。活动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈,活动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我以为卵白的聚合应该和存在的情况有很大的干系,可是纵然如此,那聚合体在反相上能有这么大的不同吗,你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试,可能你把第一个峰和后头的峰都跑电泳看是不是都是卵白,假如第一个峰也是卵白,那说明你揣度是对的,假如不是,那就是没有分隔。
我以为测定聚合体照旧用高效凝胶过滤色谱更好点,非还原电泳也应该不错,反相你可以查查文献有没有这么检测的。
今朝检测protein aggregation的要领主要有四种。
1。gel filtration. 按照专门的mark,可以揣度大抵的聚合物的分子量,不外实际应用上看,影响的因素太多了,功效很不准确。
2。native gel. 大抵上大概可以揣度聚合的水平,不外功效实在不能让人信服。凡是要与其他功效共同说明问题。
3。Dynamic light scattering:简朴利便,功效可信,常用于挑选卵白结晶的条件。可是对付浓度有限制。
4。超高速离心。

文献中多见1,3联用,3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1,2联用的,不外仅用于说明次要问题。

15) 请教左右:我想把一种配基毗连到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质,可是这种对象在必然比例的有机溶剂(如二氧六环)和水殽杂溶液中才溶解,好像看过文献提到,有机溶剂会影响琼脂糖,不知如那里理惩罚这个问题?感谢。
完全没有问题,因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中,所以它们自己不会影响到活化后的琼脂糖的,相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不消担忧,你的配基不变的话你可以用0.1MNaOH溶液殽杂你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。

16) 最近我在用sephadexG-75的胶纯化卵白,总共膨胀了3次新胶(个中第一次是一个批号,后两次是同一个批号),第一次是90度9个小时,加BSA4渡留宿,第二次是凭据安玛西亚上的时间90度3小时,还放在120度高压锅内灭菌,没有加BSA,第三次同第一次做法,功效发明,第一次的胶一开始的流速很快,按照说明书上给的线性流速可以到达37cm/h,并且判别率很高,但厥后两次,线性流速最快的时候也只有17cm/h,判别率低得多,不知道是什么原因????(我们用的玻璃管都是一样的型号)

这都很正常的处理惩罚应没有问题,可是还放在120度高压锅内灭菌不知道行不可,另外你用什么液体处理惩罚的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有大概会使布局粉碎的,你可以测定一下.假如pH没有问题,那应该说填料自己没有问题.至于流速你的样品会不会较量粘,你柱压高不高, 假如柱压高,那填料变形压缩,那流速自然慢,并且疏散结果欠好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,因此你照旧看看柱床体积有没有变革,假如缩小很明明,那你就从头装柱子.

17) 我们用c-18反向柱纯化卵白,用的活动向是1%三氟乙酸,乙腈,不知道这两种对象,在什么浓度对卵白有变性浸染。
反相一般都是做阐明的多,除非你的卵白很不变,不然不大适合做纯化,因此在有机溶剂中都有变性的大概,一般10%阁下短时间应该没有问题,高了就很难说了,虽然这也很卵白自己干系很大,假如你真的想纯化,那发起照旧改C3或C4这样温和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以共同你的活性测定找到一个符合的浓度使你的卵白活性回顾率更好,纯化进程必然要快这样也低落变性的大概.

18) 我有一单抗腹水,第一次纯化时,我先用50%硫酸铵沉淀,然后上HiTrap desalting脱盐,再过MonoQ强阴离子互换柱,用IFA检测抗体活性,归并收集峰,最后举办透析。第二次纯化时,是直接将腹水上脱盐柱,没有颠末硫酸铵沉淀,功效两次纯化功效,第二次所的卵白浓度是第一次的三倍多,纯化的抗体我主要是用来做胶体金标志,请问两种纯化进程, 反抗体的纯度会有什么影响,是否会对标志结果发生不同?
腹水中应该有一些脂溶性物质以及一些此外杂质,沉淀后应该更清洁点,直接过柱子要留意清洗,至于这两个要领详细结果如何,你可以跑电泳检测,同时也可以做抗体的活性检测,假如没有什么不同,那虽然是接纳率越高越好. 详细怎么样只有检测后才知道.

19) 用HPLC阐明获得的功效对我们用普通的层析柱纯化有什么指导意义吗?
我以为有意义如凝胶过滤的柱子,那可以知道分子量的漫衍以及此外信息,而假如是反相可以知道哪个卵白的疏水性强,用离子互换的柱子可以知道电荷的差异,总之相识的信息越多对纯化越有用,所以说都是有意义的,只是很少有先做HPLC后做纯化的,大多先纯化后用HPLC阐明.

20) 离子互换层析,一般用氯化钠洗脱,可以用氯化钙洗脱吗?
没有问题,是盐都可以,只是小心钙离子容易和磷酸盐发生沉淀,你可以用此外缓冲液就没有问题.

21) 我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种较量好,用什么活动相,PH 几多为好?目标卵白是2KD。
别客套,其实高效凝胶柱子一般用TSK系列的最多,你可以看看有没有疏散范畴窄点的柱子,只怕难有疏散范畴这么小的凝胶柱。活动相用缓冲液就可以。其实按你的分子量,用反相譬喻C3可能C4更符合,你也可以直接用C18的试试试,凝胶柱很贵,假如用不了那不是惋惜了。

增补一下,由于分子量小,可以用MS来预计disulfide bond是否形成。形成一个,分子量淘汰2(失去两个proton)。
至于复性,发起在纯化之后举办。有文献证明,卵白复性,乐成的大概随纯度的提高而提高

因为HPLC用的填料一般是5-10um的,而凡是用的填料至少也在35um以上,疏散结果不同照旧很大的,假如要把这么细的填料装在普通的柱子上,压力很大,一般的泵和系统,包罗柱子基础遭受不了那么大的压力,另外普通的层析系统的泵的精度管道等都很难担保有很高的疏散结果,可是你可以把HPLC的条件直接用普通的填料来放大制备,譬喻你摸好了HPLC的反相可能亲和以及离子互换的填料,假如它们有相应的颗粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的条件,这样只要你HPLC的条件很好,那就可以,可是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大,它也没有相应的填料.

22) 你所提及的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及判别率,详细何解?
我以为是这样的:凝胶过滤的道理是小分子能进入的孔到多于大分子的,可是假如有多糖或核酸的滋扰(很粘),这样一些小分子也不能进入更多的孔(和没有滋扰的对比),这样自然疏散结果不如没有滋扰的。这是其一。

其二是由于这些对象粘度大,那么同样流速下,由于sephadexG-75压力比泛泛的大,所以胶会压缩变形,这样它的内孔和没有滋扰的排阻极限也差异,所以疏散结果自然比没有滋扰要差。出格是压缩会使孔变得不匀称。
虽然相对而言,前面的原因是最主要的,后头是次要的。
其实不只是凝胶过滤,此外色谱有这两物质(尚有一些脂溶性的物质)也会一样滋扰传质,因此影响疏散结果。所以这两个对象一般要小心,同时它还会低落柱子的寿命。

23) 我的目标卵白是以可溶形式表达,MW=6KD,理论等电点为9.45.,无tag.我先用S-100撤除了部门杂卵白,但接着再用阳离子互换柱SP疏散(20mM PB ph=7.00),发明目标卵白基础挂不上.我想试用硫酸铵分级沉淀撤除部门杂卵白,再过s-100.但不知硫酸铵分级沉淀该如何详细操纵?
你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱,另外其实你的卵白分子量很小,杂质应该大多分子量比它大,你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来,可能上superdex 30 大于10KD的先出来,而你要的在后头,然后你再用离子互换试试,S-100疏散范畴较量宽,去杂质没有前面说的那两种好,另外你凝胶过滤后大概含盐那也挂不住,因为这样小的分子盐会和卵白一起出来的,你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的要领其实很简朴,一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀卵白,你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以,到必然的浓度离心沉淀,上清继承加硫酸铵,再离心,上清再加硫酸铵,你可以设计你的尝试,然后用电泳检测可能活性检测沉淀的结果。

24) 假如猜疑是多糖造成的黏渡过大,请问应该如何去处多糖?
多糖去除你可以用硫酸铵分级沉淀,也可以用低温乙醇分级沉淀.一般的多糖也不带电荷,你可以用离子互换挂住你的卵白,这样也是可以的

25) 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题,我的填料处理惩罚好后别人拿去用了,用了一次,功效我把他放到烧杯后,觉察已成絮状,不知有没有坏掉?可以再用吗?用什么要领可以把它规复到原状?
这个絮状的对象有颜色吗,会不会是染菌了,可能是脏的对象没有处理惩罚清洁,你可以用0.5MNaoH泡半小时,沉淀后倾去上清,做三次这样的处理惩罚,假如尚有不清洁的对象,你可以用6M盐酸胍泡半个小时,然后处理惩罚和NaoH一样,再换水,这样你看能不能洗返来,假如不能很好沉淀下来,那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌,用完得洗清洁,生存在20%的乙醇中。

26) 我想在想纯化peg修饰的卵白,但是我今朝只有弱阳离子互换的羧甲基纤维素,你看能不能纯化阿,仿佛文献上都用sp-sepharose,纤维素是不是不可啊?别的,今朝没有专门的层析装置和蠕动泵,我用普通的层析柱是不是就可以阿,流量是不是也不消太准确阿?感谢!

离子互换的要领是可以的,可是我以为疏水也很值得一做,因为修饰后电荷变革了,其实疏水性也增加了,所以这些要领都可以,另外只要你的CM纤维素能挂住就可以疏散,,SP-sepharose只是更强点,并且流速更好点,你先试试,不可再换吧。没有蠕动泵纤维素流速会较量慢吧,流量必定不准确,我以为照旧有个泵好点,没有检测器也不可,这些是纯化的基本,要不行是较量贫苦的,怕尝试难反复。况且你没有泵也没有步伐做线性剃度洗脱。横竖是太简朴点。

27) 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题,我的填料处理惩罚好后别人拿去用了,用了一次,功效我把他放到烧杯后,觉察已成絮状,不知有没有坏掉?可以再用吗?用什么要领可以把它规复到原状?
这个絮状的对象有颜色吗,会不会是染菌了,可能是脏的对象没有处理惩罚清洁,你可以用0.5MNaoH泡半小时,沉淀后倾去上清,做三次这样的处理惩罚,假如尚有不清洁的对象,你可以用6M盐酸胍泡半个小时,然后处理惩罚和NaoH一样,再换水,这样你看能不能洗返来,假如不能很好沉淀下来,那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌,用完得洗清洁,生存在20%的乙醇中。

28) 首先我想问一下agarose和sepharose区别,我的领略是:都指琼脂糖,但agarose是未毗连其他介质的,而sepharose是毗连其他介质的,不知领略对差池?请指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一种对象吗?
其次,我想问一下你纯化过GST融合卵白没有?我现纯化一个融合卵白(某种酶和GST融合),我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不行以这样做.而产物说明书上说做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,装介质的柱子的高度和直径有要求吗?

agarose是凡是的琼脂糖的英文名称,各人都这么叫,它不是商品的注册名称。而sepharose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品名称。所以你领略是有毛病的,另外agarose不必然是琼脂糖凝胶,而Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一类对象,只是厂家差异。
GST融合卵白纯化过,5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用,也可以凭据分子克隆的做法做,取决于你的爱好和利便。1ml欠好装,除非有专门的小柱子,对付直径和高度没有出格的要求,我们的做法是:

1、 GST琼脂糖凝胶FF装柱,0.7X2.5cm,柱床体积为1ml;
2、 用缓冲液1均衡5个床体积,流速为1ml/min;
3、 将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml,0.45μm滤膜过滤,上样。流速为1ml/min;
4、 用缓冲液1再洗10个床体积,流速为1ml/min;
5、 用缓冲液2洗脱,流速为1ml/min,收集洗脱峰
6、 用纯水洗5个柱床体积,再用20%的乙醇洗5个柱床体积,流速为1ml/min,柱子置于+4~8℃情况中生存

缓冲液构成:
缓冲液1:20 mM磷酸盐缓冲液,pH7.4,即pH7.4的PBS溶液。配制:0.2 M NaH2PO4 19ml,0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
缓冲液2:50mM Tris-盐酸缓冲液,pH8.0,配制:0.1M Tris 50ml,0.1 M 盐酸29.2ml,307mg还原型谷胱甘肽,加水至1000ml。

29) 请问con A sepharose 4B 亲和凝胶利用前的处理惩罚要领?
不需要出格处理惩罚,直接均衡后就可以上样了。
30) 感谢,我想问一下,是不是离子互换必需要线形梯度洗脱较量好呢?照旧阶段洗脱好?检测器我想先收集然后再去测紫外。
也不是,有的时候阶段洗脱结果就很好,并且容易放大,不需要仪器,我较量喜欢,结果差不多,可是很省事.可是要害是容易反复.紫外分担测定那也可以,我上学也那样做过.

31) 我要从总卵白中提出250KD的NF1卵白做western,由于量少所以要做免疫沉淀。我是操作小鼠来历的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、protein A-sepharose来做免疫沉淀,发明做完后跑电泳,呈现了两条带,别离位于85KD、55KD阁下,请问这会是什么对象?会是抗体吗?尚有没有大概是方针卵白变小了?

歉仄,我没有做过免疫沉淀,可是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的境地,所以应该不是抗体.会不会你的卵白有四个部门组成,别离是两个85KD和55KD,这样分子量正好和你的250KD相当,你可以跑非还原电泳看看,是不是还这样呢.假如不是,那说明是由这两个部门构成的.都是由二硫键毗连的.

32) 我提胰卵白酶,主要参考用张龙翔书里的步伐,先提卵类粘卵白,首先过SEPHADEX G-25 柱子脱盐,然后过DEAE纤维素离子互换柱;第二步是用卵类粘卵白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析进程都可以在缓冲液内里加0.02%的叠氮化钠抑菌吗?今后奈何去除?
我提胰卵白酶粗酶用的乙醇,可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗?浓度多大为好?
那尝试我知道,你用什么要领活化琼脂糖呢,胰蛋酶的亲和纯化要领许多,配基有大豆胰卵白酶抑制剂,抑肽酶,苯甲脒类,出格是后头的苯甲脒,可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶,何须本身去提取呢,感受较量巨大,本身偶联这些配基也可以,层析进程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌,只管不要加,那透析可能除盐柱子都可以,可能直接上一样的亲和柱子,用不含这个的缓冲液洗,最后洗脱下来就可以了。
最好照旧用乙醇,浓度很难说,因为和你的卵白浓度有关,此外醇用得很少。另外你可以思量用硫酸铵沉淀,这样对活性更好些。纯化也可以用疏水,因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附,共同硫酸铵沉淀也是不错的选择。

33) 楼主,我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有没有浓缩浸染,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,但是,我却没有使纯化的卵白浓缩,我想获得浓度较高的卵白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的卵白浓度会较高,
亲和,疏水,离子互换都可以浓缩样品,可是离子互换是最自制的,苯基可以浓缩,可是想有好的浓缩结果,最好用一次洗脱可能阶段洗脱的要领,我发起你先用离子互换柱子挂住,然后直接用高盐洗脱,因为不知道你卵白的等电点,所以不知道你该选什么柱子。假如样品含盐高,那可以用疏水,然后直接用缓冲液洗脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求,柱子看你手头有什么,离子互换是最常用的。上点样

34) 我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步利用氧化铝物理吸附,利用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩,但是结果很差,根基是起不到浓缩的浸染.
我做了好屡次,都是这样,但是前面有人做的时候起到浓缩的浸染,我此刻却做不出来,也接洽不上以前做过的人.

phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析,我此刻就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的照旧小的,洗脱卵白时会使洗脱的卵白峰值高一些,感谢
这个酶纯化应该可以用亲和的要领做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,可是除盐欠好,你想浓缩结果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的结果好,那只管用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.另外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样担保能浓缩好你的样品.

35) 楼主:这段在用离子互换柱过抗体,请问抗体的接收图谱是奈何的?它的特征接收峰在那边,差异的多克隆抗体是不是尚有本身的特征接收峰,
歉仄,你是说色谱图照旧紫外接收图呢,卵白一般都是在280检测的呀,差异的的卵白固然有一点不同,可是那也不是很明明的,其实就用280就可以了.

36) 我的卵白以GST融合卵白的形式表达在E Coli中,分子量14~15kDa,卵白的疏水性很强,等电点在7阁下。菌破碎后,用外貌活性剂提取的融合卵白,据文献说是由于此卵白和细胞膜团结,所以假如不加外貌活性剂,上清中电泳检测不到。加外貌活性剂后,提取效率还可以。上GST 胶。开始时回收先洗脱融合卵白,再酶切,洗脱回收10mM GSH洗脱,没有加外貌活性剂。然后酶切后,就会发生大量沉淀,上清中没有目标卵白。厥后在酶切buffer中也加外貌活性剂,就获得了改进,没有再呈现沉淀,目标卵白也存在于上清中。目标卵白中仅有一个cys。

我的问题是:
1、老板不知从那看了篇文献,是专门讲此卵白的布局的。不外人家的卵白是合成出来的,然后用反相C18(300A孔径)疏散的。他非要我不上GST胶(因为binding 效率不是很高,GST价值很贵,家产化仿佛也没几家),提取液先酶切,沉淀后离心上反相疏散。我以为沉淀中的杂质构成不很清楚,假如有大一点的卵白变性沉淀之类,用反相会不会很容易堵柱子?我看一些资料,反相只用来疏散或阐明短肽,较罕用于疏散较大的卵白,尤其是我的杂质都不清楚的环境下。
2、已往曾做过superdex200 10/300疏散酶切产品时,由于目标卵白聚积,我也没有marker,每个峰较难定性,电泳看不出来,大概是浓度太低。我想用反相有没有大概成立一种便捷的阐明要领来阐明纯化进程中目标卵白的量?

3、我的卵白酶什么好的测活要领,只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理条件下,我的卵白没有二级布局,尽量在必然浓度下未沉淀,可是都以多聚体存在,假如插手50% TFE(三氟乙醇,trifluorethanol),则可使其在中性pH下规复二级布局,此时大部门以二聚体存在。那么,你用过TFE防备聚积么?这样做有什么按照么?好象一般都只用外貌活性剂(对细胞有毒性),或L-arg,PEG之类的,可我没找到在L-arg和PEG存在下,目标卵白的布局成果方面的文献。此刻不清楚多聚体是否就必然没有活性?郁闷阿,望多多指教!

4、我的GST团结效率不很高,总有部门流穿(应该没有高出载量),而放慢流速更改也不明明,厥后团结的时候binding buffer中也加外貌活性剂稍微好一点,但照旧不满足。我曾试过把流穿收集再进GST柱,但是险些不团结,所以我猜疑GST部门大概有变性和稳定性两部门。我曾看过一文章,提取时回收离子型外貌活性剂,binding时在插手triton X-100,回收殽杂外貌活性剂,听说可以使GST部门复性,增加binding,我还没有试过。

您有这方面的履历么?多谢了

1,其实反相价值会更好点,因为有呆板,柱子和活动相也不自制,其实我们用的是国产的GST融合卵白的纯化系统,价值就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份质料,反相柱子其实做不了几多对象,所以发起你别用它制备.
2.只要你有尺度卵白,那用HPLC做阐明取代电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,并且定量很精确.
3.三氟乙醇我的观点是低落了极性,这样你的卵白不会因为(情况极性大)疏水彼此浸染太强和聚积,至于活性那你多查文献看有没有此外测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有大概是因为有些方针卵白的布局和能挂上的纷歧样,那你可以试试低落上样的浓度,包罗低落疏水性,加外貌活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那必定挂不上.

37) 色谱兄可否推荐几种不错的离子互换介质呢?我此刻知道有羧甲基纤维素,sp-sepharose等,可是砝码西亚的sp-sepharose太贵了,450/25ml。你能推荐一下较量不错的介质吗?物美价廉的,感谢!
维素欠好操纵,照旧用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的质料.

38) 一是电泳后凝胶内里德卵白质有什么靠得住的要领接纳?
二是我此刻有个GST融合卵白,用thrombin酶切后的目标卵白条带很弱,请问大概是什么原因有什么步伐办理

还真没有做过,你可以用电洗脱的要领,然后浓缩可以用离子互换不就行了可能透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以实验增加酶的量,或耽误酶切时间,.另外看有pH有没有问题,你的卵白浓度是不是太低.

39) 我所说的大颗粒是指卵白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。感谢!

完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把许多小分子的卵白去除,再过离子互换就可以较量纯了病毒.病毒都可以,那大分子的卵白也没有问题,包罗质粒也可以用凝胶过滤纯化.

40) 感谢chromatography的复原。介质有现成的,但很贵啊。我要疏散谷胱甘肽还原酶,文献都是用2',5'-ADP-Sepharose 4B纯化,今后你多寄望点, 

别客套,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,另外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,可能专门合成一个雷同底物的也可以,其实你完全可以本身合成填料的.也许这样能很好地办理你纯化的问题.

41) 我用环氧氯丙烷活化琼脂糖,到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶?GOOGLE 搜不到。我们没冷室,层析进程加什么来抑菌?我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解,可以吗?
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢,我有国产甲脒琼脂糖凝胶的质料,你pM你的邮件,我把质料发给你,层析进程水是活动的,所以不会长菌,不需要抑菌,层析柱灌满20%的乙醇,放在冰箱4度中生存好久都没有问题。

42) 查尔酮合成酶的酶活要用同位素要领测定,而我的条件没步伐测所以需要送到此外处所测。这会造成很大的贫苦,请问chromatography 有没有人做过的,有没有好的要领可以警惕?别的一个问题是:操作疏散纯化这个卵白的填料中有没有亲和偶联剂?我一直都没有查到过。
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力,你完全可以本身合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,结果不错,我以为你可以用亲和的步伐,纵然是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个卵白.因为它和芬芳环有很特异亲和力.
你说的亲和偶联剂是配基照旧活化的填料呢.

43) 请问,假如所提卵白质浓度低,如何举办浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法,但沉淀很难溶解,没法往下作了。有没有更好的要领?感谢!
那你直接把你的样品放在透析袋中,然后在外面用PEG8000粉末浓缩,这样就好了,你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌环境下迟钝加冷丙酮,制止局部浓渡过高,另外沉淀后顿时离心,这样也可以制止变性而不溶解。

44) 三氟乙醇我的观点是低落了极性,这样你的卵白不会因为(情况极性大)疏水彼此浸染太强和聚积,至于活性那你多查文献看有没有此外测法了.

关于TFE对付a-helix的形成,此刻有两种概念。
1。TFE能不变a-helix的形成,及这个卵白原来就是a-helix的布局,可是由于dynamic太严重了,或其他的因素,造成表观上看不见。插手TFE可以或许不变之,使之表观可见,用CD啊什么可以看获得。
2。TFE能使卵白酿成a-helix。及这个卵白原来不是a-helix的,可是由于插手TFE的浸染,使之酿成a-helix。
详细的道理我就没仔细读了,不外这两方都有必然的文献证明,此刻还不知道谁对! ^_^

45) 我是需要在兔肝中纯化一种酶,并且我是方才打仗卵白纯化我有几个问题想请教:
1 : 我的目标卵白在强阴离子柱上团结(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),可是好像结协力很弱(因为上样时就有少量卵白flowthrough,并且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始呈现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,卵白的结协力仿佛照旧很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改进我的问题么?
2: 由于目标卵白品貌低易失活,并且尝试室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品卵白含量低体积大,我想请教:我接下来概略积上疏水柱能行么?会很大的影响我的判别率么?我的卵白在疏水柱上结协力很强,老是到梯度最末才洗出来,我该奈何优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ,可是由于经济上的原因不能用特异的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是疏散结果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了呆板,只能用手工做,这样做梯度极端贫苦)
4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐均衡液下,为什么绝大部门(95%以上)卵白都团结不上去呢?我最好要把PH值降到几多去试?6.8符合么?
感谢你的指导!!
1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样大概会好些,另外假如照旧很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,可是有的卵白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要低落到5-10mM也许能更好点.
2.概略积直接上疏水没有问题,既然你的方针卵白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,基础不需要走梯度,这样快,疏散结果也不差,并且这样洗脱的体积小,容易放大.
3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更自制点,洗脱用盐没有干系,不需要竞争洗脱,况且那样染料很难去清洁.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的要领,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多探索,你会找到个符合的浓度,结果一样很好,没有问题.
4.挂不上你是指的亲和照旧离子互换呢,我想假如是亲和,那你可以低落pH,同时还一个缓冲体系,我以为主要在pH,你低落到4-5那挂得就较量好一些吧.

46) 1.我正是用的Q柱呈现的上述问题,
2. red A 确实是一种染料亲和,
3.我说的挂不上是在souce 30 S 和streamline sp上样的体积
4.你用akta的设备么?我用purifier 100 ,发明电导值老是稍迟于开始的梯度.

1,那你按我提议试试吧,低落缓冲液浓度,提高pH值.
2.那它的布局和我说的谁人染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,布局也相似.
3,挂不上那也大概,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是几多呢.
4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变革,所以稍迟.

47) 你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱,另外其实你的卵白分子量很小,杂质应该大多分子量比它大,你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来,可能上superdex 30 大于10KD的先出来,而你要的在后头,然后你再用离子互换试试,S-100疏散范畴较量宽,去杂质没有前面说的那两种好,另外你凝胶过滤后大概含盐那也挂不住,因为这样小的分子盐会和卵白一起出来的,你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的要领其实很简朴,一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀卵白,你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以,到必然的浓度离心沉淀,上清继承加硫酸铵,再离心,上清再加硫酸铵,你可以设计你的尝试,然后用电泳检测可能活性检测沉淀的结果。

多谢你的回覆,可是我把缓冲液PH 调到5.6,我的目标卵白仍挂不上 SP柱(我是一个新手,正在做卵白纯化.我的目标卵白是以可溶形式表达,MW=6KD,理论等电点为9.45.,无tag.我先用S-100撤除了部门杂卵白,但接着再用阳离子互换柱SP疏散(20mM PB ph=7.00),发明目标卵白基础挂不上.),是不是理论IP与实际有相差?



48) 有大概还在柱子上,假如你所有的组分都检测了没有活性,那这样的大概性很大,你可以用0.5,1M的NaCl别离洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶不变吗.
我的酶还算较量不变,4C下活性至少三天不丧失,也有报道一周不改变,-20C时间就更长了。

49) 问一个大概是较量业余的问题,此刻我想通过真核表到获得纯的卵白,然后勒索抗,可是许多人汇报我真核表达最大的问题就是获得的卵白很是难纯化,许多人都这样说,所以科室里就没有人去试,实际上我以为通过真核表达获得纯卵白是最好的途径,所以想问一下,怎么样能把真核表达的卵白纯化出来,感谢。

50) 多谢你的回覆,可是我把缓冲液PH 调到5.6,我的目标卵白仍挂不上 SP柱(我是一个新手,正在做卵白纯化.我的目标卵白是以可溶形式表达,MW=6KD,理论等电点为9.45.,无tag.我先用S-100撤除了部门杂卵白,但接着再用阳离子互换柱SP疏散(20mM PB ph=7.00),发明目标卵白基础挂不上.),是不是理论IP与实际有相差?

理论上的和实际是有不同,可是不会这么大,你的样品中盐的含量高不高呢,有盐也会挂不住的。

51) 我的酶还算较量不变,4C下活性至少三天不丧失,也有报道一周不改变,-20C时间就更长了。
我别离用了0.5M,1M的NaCl洗柱子,测卵白浓度照旧很低,中间有几个管浓度较高,然后测酶活却发明活性依然很低,上柱前测的尚有441IU/10ul,而收集管里的顶多只有20IU/50ul。
所以,我很猜疑它到底挂在柱子上没有,于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液,发明酶活居然有100IU/50ul,我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢,0.011M柠檬酸-氢氧化钠,PH5.5?然后就用的是手工步进式洗脱,0.05M,0.1M,0.15M,0.2M,0.25MNaCl,直到厥后的0.5M,1M.
别的,我还想请教您:
阳离子层析柱用完后如何生存?先用1M氢氧化钠溶液,然后再用含硫柳汞的缓冲液,行吗?可不行以用其他的防腐剂呢?如有,能否推荐一下?硫柳汞我这里包装大,25g,又不能分装,需要避光生存,先感谢了!

那用更高点的盐洗脱看看,譬喻2M,假如照旧没有下来,那也许是沉淀在柱子上了,但是假如吸附,你的穿透应该活性很小才是,但是穿透好象有不少,是不是没有挂住呢。
生存你用20%的乙醇过柱子就可以,然后在低温4-8度就可以,没有须要用硫柳汞。

52) 问一个大概是较量业余的问题,此刻我想通过真核表到获得纯的卵白,然后勒索抗,可是许多人汇报我真核表达最大的问题就是获得的卵白很是难纯化,许多人都这样说,所以科室里就没有人去试,实际上我以为通过真核表达获得纯卵白是最好的途径,所以想问一下,怎么样能把真核表达的卵白纯化出来,感谢。
纯化和表达系统有一些干系,可是最重要的照旧看卵白的特性,所以不必然真核就欠好纯化,所以我以为不消担忧。纯化的要领你可以用离子互换等纯化要领,详细很难说,得看你的方针卵白而定。

53) 你好,我想请教一下,我此刻在做包容体卵白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,可是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否遇到过这类问题.并且我的卵白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液此刻用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的发起呢,感谢.
要复性你的卵白浓度就不能高,这样你溶解你的方针卵白也就不需要那么高的盐酸胍了,这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.1mg/ml,详细环境得看你的卵白,我发起你可以用简朴点的稀释复性可能透析试试,假如不是出格巨大的复性最好能用简朴的要领,别过柱子。

54) 欠盛情思,什么叫穿透啊?不懂唉,请指教。
别的,我还想问一下“互换纤维素解离基团的pK值”?,“用阴离子互换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液,用阳离子互换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么意思,感谢!

所谓穿透就是上样后用及均衡缓冲液洗下来没有被吸附的部门叫穿透,pK值用于暗示酸碱性的强弱,阴离子互换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才气带正电荷,用于互换带负电荷的样品,不然就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才气解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.不然也挂不住.

55) 我做得GST融合纯化,目标卵白在66KD四周,但每次纯化出来的总有杂带,出格是最近的一条带,浓度较大,岂论降温照旧改变诱导剂浓度始终去不掉,您有什么卓识,感谢。
这样纯化的卵白可以免疫动物,没有问题

56) 向您请教一个问题,我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目标卵白,目标卵白的两头都带His-tag,卵白的巨细为37kD,在操作Ni-NTA纯化时老是在目标卵白带旁边陪伴一条带去除不了,请问有什么高着可以办理这个问题?!!!另外,该表达产品为包容体,请问这种产品可不行以直接用来制备抗体?感谢!!!

也许这两个都是你要的方针卵白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,假如是,那说明是这样的环境.另外你可以再均衡缓冲液中加0.5%的吐温等外貌活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,另外你可以用pH45阁下的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.假如你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明大概是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,留意温度,因为超声有时候也大概会使卵白降解.

57) 我做得GST融合纯化,目标卵白在66KD四周,但每次纯化出来的总有杂带,出格是最近的一条带,浓度较大,岂论降温照旧改变诱导剂浓度始终去不掉,您有什么卓识,感谢。
你可以在你的均衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以低落一些因为离子浸染带来的非特异吸附.同时在均衡液里加0.5%吐温等外貌活性剂,这样是不是有点改进,另外你也可以用阶段洗脱的要领,譬喻用5mM和10mM还原谷胱甘肽去别拜别洗脱,这样看看有没有什么区别.另外还要留意的问题是超声破碎时留意功率和时间.制止过强时间过长,降解卵白.
另外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的对象,会不会是降解或造成这样的功效。你可以加点酶的抑制剂,另外歉仄我不是主任,嘿嘿。

58) 我筹备用30%-60%硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl-sephorase柱。但发明活性大部门还在沉淀中。测了一下卵白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊?
30%-60%硫酸铵沉淀大概对你的目标卵白来讲,太大致了,如你所言,目标卵白大概在沉淀中,能否分级沉淀,30%-50%,50%-60%,再测一下活性大概就分隔了,20mg/ml的卵白浓度对付层析是有点高,洗脱液浓度变革或PH的改变城市使卵白有损失,最好不要高出10mg/ml。

59) 我的卵白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的,表达量很高,形成包容体,为了得到可溶性卵白,我此刻实验用较低浓度的诱导剂诱导,此前用差异浓度诱导做过比拟,电泳后表达量的差别不大;但当我再低落温度诱导后发明,超声处理惩罚后的上清液中目标卵白条带很微弱,大部门目标卵白照旧在沉淀中;这和我低落诱导剂前做的纷歧样(同温度),为什么目标卵白的可溶表达会不不变呢?对同一菌种应该是牢靠的吧?我很疑惑.
别的,请问,一般环境下28度,30度诱导时间应该别离几多才符合?我们的光度计出了点问题,无法测定OD值.感谢.
尚有,你有没有较好的卵白纯化的文献先容几篇,好吗?

60) chromatography 兄,请教一个问题:
选择填料的时候,CM和SP怎么选择?什么时候选择弱阳?什么时候选择强阳?
再问一个:
我们尝试室有两种卵白,一种等电点5阁下,另一种等电点9阁下,为什么都可以用CM阳离子互换纯化?(用的缓冲液都呈中性)
等电点5的谁人我以为选择阴离子互换柱好些,为什么不这样?
没有什么出格的原则,重要是纯化的结果好就可以,一般都是先选择弱的.
纯化是把方针卵白和杂质分隔就可以,所以其实在这样的环境下,酸性卵白是挂在阴离子柱上,尔后头的挂不住,可是只要能把它们和杂质分隔就可以.所以酸性卵白流穿,杂质被吸附也可以,所以不必然非要吸附也可以.


61) 我筹备用30%-60%硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl-sephorase柱。但发明活性大部门还在沉淀中。测了一下卵白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊?

也不是,其实沉淀你可以做仔细点,譬喻先用30%沉淀,取上清,再把上清加到40%,然后如此类推,一直到60%,然后测定沉淀和最后上清的活性,这样就知道哪样的浓度沉淀结果较量好,既然你的活性都在沉淀里,那直接溶解在必然浓度的盐中,直接过滤上柱子就可以,浓度高也没有干系.

62) 急问:我的样品卵白液原来放在4C生存,谁知有人把温度调到了18C已有一天,请问这样对卵白会有多大影响?我纯化的是一种酶。别的,树脂在这样的温度下性质会有所改变吗?或人说4C-30C的环境下,树脂不会有太大改变。是这样么?感谢!
不知道你的卵白不变不不变,你可以测定一下活性看看,假如没有什么变革,那就没有干系,树脂不会因为温度有什么变革的,尤其是你的树脂不是以卵白为配基的亲和填料.,没错在4C-30C的环境下是没有几多改变,可是那也看多长时间,什么树脂,因为时间长会长菌假如不加抑菌法子的话.

63) 我用鼎国的sepharose 4-B 合完婚和柱可以吗?
是活化好的吗,照旧普通的琼脂糖,他们的填料颗粒有的较量粗,不知道你选择的粒径是几多范畴的,最好要细一些,45-165um较量好,用一般应该没有问题.

64) 好比说,sephadex G-25的分级范畴是1000~5000,我想问一下,分子量小于1000的分子(譬喻盐)是怎么样通过的?它是从凝胶内部通过吗?不是说只有1000~5000巨细的分子从凝胶内部通过吗?
凝胶的中间有的是巨细差异的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的疏散范畴也只是说在这样的分子范畴内有不同,分开这个范畴就没有疏散结果,所以小的和大的都没有什么疏散结果,因此不是只有1000~5000巨细的分子从凝胶内部通过.而是在这个范畴的分子有疏散结果.

65) 请教:要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽,前期的提取回收的是酸沉醇提的要领,粗提物中卵白含量39mg/ml。资料上说,纯化这个小肽要用sephadexLH-20,但是我没有。:(实验用sephadax G15 举办了纯化,呈现了五个没有分隔的峰,第六个峰分的还算可以。思量到大概是粗提物中的组分太多,于是对粗提物用sephadex G200举办了纯化,获得一个单一峰,收集后,冷冻干燥,再过sephadex G50,获得两个接收峰,但是尝试发明,这两个接收峰没有抑菌活性了:(洗脱液用的是pH7.0的PBS,检测波长280nm。请问大概呈现的问题有哪些?洗脱液选择的有问题?检测波长有问题?{我的这种多肽,资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的。}

你的问题很不明晰,用sephadexLH-20纯化除了有一部门凝胶过滤外,尚有一些分派色谱的浸染,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出几多峰都应该举办抑菌尝试,不然很难知道你要的组分在那边.既然这个分子量这么小,那你上sephadex G200,预计你的方针多肽在最后头,所以你获得的谁人峰不必然有你要的对象,而在后头,我是这样揣摩的,要害你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对差池,要害你要选择符合的柱子,同时每一步都做活性检测.

我确实是对每个峰都作了抑菌尝试,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只获得了一个接收峰,要是我要的组分在后头,可它连个小峰都没有呀.。另外,有人发起我,先利用硅胶柱对粗提物举办处理惩罚,请问可供选择的柱子有哪些?感谢。

那你没有说明G200的峰是不是有活性,你也可以思量硅胶填料,那得选择c8可能c4的反相硅胶的柱子,可以做HPLC,这样也是不错的选择,究竟凡是的凝胶柱子很难有很好的疏散结果。

66) 假如我用sephadex G-25脱盐,如何选择缓冲液?因为我认为,假如选择含盐的缓冲液,自己带入了盐,能起到脱盐的结果吗?假如选择含盐的缓冲液,
缓冲液里含有的盐会最后流出来吗?
别的,分子筛有没有载量的问题?
缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么出格的要求.你的缓冲液虽然是没有盐的,不然那何须除盐呢.含盐缓冲液虽然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的道理是卵白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.假如你缓冲液中有盐那固然盐有后出的道理,可是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是纷歧样的.
分子筛其实也有载量的问题,可是要害照旧看上样的体积,譬喻疏散上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,详细的数和样品有很大干系.

67) 既然这样,我想完全脱盐时,洗脱液可以选择水吗?因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在,对差池?
是的,只要你的样品在水中溶解得很好,并且很不变,那选择水就可以.

68) 请教色谱兄,我此刻用纤维素疏散纯化卵白和peg-卵白,跑完我用page检测了一下,没有完全分隔,有一些是一起流出来的,我想知道为什么疏散结果欠好?我该如何调解阿?加长柱子可行吗?照旧要改换介质阿?我用的梯度洗脱。多谢拉!
peg-卵白要想完全分隔是较量坚苦的,因为PEG修饰的水平纷歧样,所很难完全分隔,不外纤维素疏散的结果是要差点,你可以通过耽误柱子,低落流速,耽误梯度的步伐来提高判别率,不可你可以换琼脂糖系列的,可是我以为你也可以思量疏水,这两个要领都可以.另外洗脱你也可以用差异盐浓度阶段洗脱,这样有时候疏散结果也不比梯度的差.

69) 很是感激色谱兄,琼脂糖的比纤维素的好许多吗?别的,上次你给我了份质料没有价值,可否给份有价值的质料,这样也好和老板谈谈,因为老板节制的挺严,感谢!!flyhyx@yahoo.com
有的,到时候发给你吧。琼脂糖必定比纤维素疏散结果要好,载量也大,尚有就是柱床体积不会变革,流速高。

70) 想请较:质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效疏散(制备局限),且不利用plasmidselect之类亲和介质。
亲和是最有效的要领,我们有现成的工艺,包罗去内毒素,你可以把你的邮件pM给我,我给你发一份相关的质料,你可以看看。

71) 我所纯化的卵白质或许是66kDalton,举办的亲和纯化。此刻呈现几个问题想请教:
1。用的Ni-NTA举办亲和纯化,以前一直是在250mM咪唑中洗下方针带,此刻50mM就有,是不是我的镍柱不太好使。
2。因为亲和纯化后我的卵白在最上面,所以我此刻用sephadex G-100,可是我发明结果很差,不只接纳率低,并且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的方针带下面不久就有一个小的杂带,并且我想把我的卵白去结晶,那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化质料差池,并且对付流速和柱子长度要求就很严格了。
有大概你的载量下降了,所以才那样,你需要清洗了。
我以为你最好选择新的填料,其实你要是条件好的话,仅一步就可以纯化到95%,我可以把我们的要领汇报你,你pM你的邮件给我就好了。



72) 1。我的卵白bind在C4 column 上了,100%的ACN都没步伐洗下来,异丙醇也试过了,尚有什么好要领?
2。在跑RP-HPLC的时候,假如样品的盐浓度太高了,有影响么?
那实在不型可以思量极性更低的乙酸乙酯等物质.另外洗不下来有没有大概变性沉淀在柱子上下不来,你的100%的ACN内里有三氟乙酸吗,我以为出不来的原因有不少,不必然仅是洗脱的问题,所以用反相疏散卵白照旧得很小心,另外不知道你的柱子是不是专门用于纯化卵白的,因为孔径太小也不适合疏散卵白.

ACN 中含有1%的TFE。
有大概是卵白变性,能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么?
不外在用isopropanol洗的时候,会有一些峰,但仿佛老是洗不清洁
column 是专门用来纯化卵白的,是C4。 不知道孔径是几多,不外C4的应该都差不多把。

我以为假如是沉淀也有大概,要不你就少上点样,可能低落上样的浓度,另外只管洗脱要快点,用变性剂怕不是好的要领,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更贫苦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以制止吸附力太强而洗脱坚苦.
我想柱子应该没有问题.要领也没有错.

73) 想请教细胞外基质中的卵白奈何抽提。
这个可真的没有做过,不外一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来历的样品,另外假如脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的卵白也应该是用这些要领吧.

74) 请问聚乙二醇的检测波长是几多?
聚乙二醇是没有紫外接收的,所以没有检测波长,纵然有接收,那也只在210nm四周有弱结尾接收,而许多物质在这个波长城市有接收,所以检测它怕是不容易.

75) 怎么有效的去除卵白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的要领?
你用透析或超滤试试吧,尚有个要领是用冷的丙酮沉淀卵白,这样外貌活性剂照旧溶解的,这样也可以去除.
用冷的丙酮沉淀卵白,那么丙酮容易去掉吗?假如试试superfine g-25脱盐的要领去掉triton,可行吗?
丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,可是假如它是和SDS一样能和卵白团结,那用凡是这些除盐,透析,超滤都没有步伐去除,只能用沉淀的步伐,并且是用酸性丙酮沉淀才气去除.

76) 那么,mPEG-maleimide的检测波长是几多?
maleimide应该有紫外接收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征接收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,可能你选几个波长做HPLC也可以,只要没有滋扰就可以了.

77) 我此刻想纯化一种卵白,我的卵白是14kD的碱性卵白质,流程是这样的:原核细胞内卵白表达,裂解细胞,SP-sepharose盐离子层析,HPLC Mono S过柱,去盐,HPLC C18过柱,最后获得纯化的卵白。上面是一个成熟的protocol,我一直没有做过卵白纯化,所以想向斑竹请教,HPLC上样量这么小,我有5ml的量,要多久才完成?
我以为为什么要用两次强的阳离子互换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,尔后再上HPLC,其实假如你的纯化假如做得好,不上HPLC也有大概,除非你们这个卵白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我以为纯化照旧尽大概不消HPLC的最好,不然本钱高,并且欠好放大.

78) 你好,我的目标卵白是GST融合卵白,巨细为42kD(包罗GST),大肠杆菌表达,我想请教一下其纯化要领。
那很简朴,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以获得你的卵白.假如你的卵白是包容体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的质料供你参考.

79) 有没有较量好的国产疏水层析填料,虽然是做卵白的?

国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目次,不知道你需要几多量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,尚有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不行超越的.

80) 我的课题涉及多次差异卵白质的纯化,我现有海外的一个protocol可以参考,但海内尝试室的条件有限,担忧假如任意变动纯化要领,功效不抱负时又欠好阐明原因。十分地苦恼,想听听您的发起,不胜谢谢!
我纯化的第一个卵白质,是由稀释复性而得的三个亚基构成的复合物,这里纯化的目标主要是脱盐改换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化进程)。我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml,下一步筹备用透析脱盐及超滤浓缩,但对付超滤离心管的选择还无头绪(条件有限不行能添置大型超滤设备),上网查也不得方式,假如您有相关资料,能不能发到我的邮箱?junewu@sohu.com. 关于浓缩的要领,冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何黑白?冷冻抽干法和硫酸胺沉淀法会不会粉碎卵白的活性?蔗糖会不会影响后续的超滤?
我纯化的第二个卵白质,是颠末酶催化的该复合物(110KD),这里纯化的目标主要是去除体系中未构成复合物的单个亚基(36KD、13KD、1KD)及36KD亚基的aggregate,海外的protocol推荐用凝胶层析,但我询问做过的人说疏散的结果并不抱负(原因不清),我是应该优化凝胶层析的步调照旧应该选用其它的层析要领?没有蠕动泵和收集器(只有层析柱和低温冰箱)能不能做凝胶层析?假如能做如何只管提高其疏散结果?选择层析柱和填料有哪些原则和留意事项?
Native-PAGE时,样品的盐离子浓度和样品内的其它卵白质会不会影响电泳功效呈阴性?Native-PAGE和一般SDS-PAGE差异之处是否仅仅在于: 凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS;样品中不加DTT或β-巯基乙醇,不经100℃煮沸处理惩罚;电泳时保持较低的温度(4℃)?
问题多多,实在是因为本人是初次涉及卵白质纯化规模的外行人,除了您推荐过的书,您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操纵手册(您假如有买了产物才气得到的,可否也EMAIL惠赠?)感谢!!!
1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以,这样体积不会变大,同时透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩,很利便,超滤包罗离心管都不自制,并且样品不多怕损失多,所以我以为照旧用简朴的要领好.
至于浓缩,有条件那用冷冻干燥,超滤都是不错的,硫酸铵沉淀不能看成浓缩的手段,因为它需要卵白到必然的浓度,并且浓缩后的样品要除盐,接纳率也不高,透析袋+PEG浓缩我以为也是不错的要领,出格适合没有超滤和冷冻干燥的尝试室,并且本钱低,适合小量不适合大量,蔗糖浓缩我们用过,应该欠好用.冷冻干燥和硫酸铵沉淀一般卵白都不会失活的.蔗糖一般不影响超滤,只是粘度增加,这样超滤会慢的.

2.既然文献是用凝胶过滤,你也用完全没有问题,我以为疏散这些分子量不同较量大的,那凝胶过滤是不错的选择,只要选择好符合的填料,装好柱子就可以,层析的根基条件照旧要的,包罗泵,检测器,记录仪,要不很难知道收集也不利便操纵.填料的选择主要看你的方针卵白和杂质分子量的不同,譬喻你的110KD和那些36KD以下的,那你可以这样选择sephadex G 75,你的这些36KD以下都在它3000-80000之内,而你的110KD在外水体积直接就出来,后头的都是小分子的,虽然也可以选择Superdex 75,它的疏散范畴在70000-3000,只是它们价值差异,后头的填料刚性更好流速快,前面的自制,流速慢些,这些就看你的经费了.
3.电泳此外卵白不该该影响,可是盐是有影响的,所以样品要除盐,可以用凝胶过滤,透析,超滤除盐.保持底温也许是为了保持卵白的活性,做小量制备.
4.~purification/Purification_Protocols.html
这个网站有不少相关的质料,相信很有辅佐,另外我可以把我们全部的质料发给你,但愿对你有所辅佐.

81) 假如疏散50KD,36KD,13KD这三种卵白质,最好选用那种凝胶层析用填料?如何确定需用的层析柱的直径和高度?
2.假如实在没有泵,上样时应留意些什么?没有检测器和记录仪,最短的收集隔断时间是多长?
选择sephadex G75可能superdex 75,柱子的巨细一般都是按你的处理惩罚量算的,凡是的柱子大多是1.6x60,2.6x60,可能有100cm的柱子,内径为1.6可能2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
2没有泵那我以为凝胶过滤很难收集样品,除非你用自动分部收集器按必然的体积去收集,然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度,这样再按照每管的卵白浓度做个色谱图,按峰型把各管归并,上样留意要沿柱子的附近迟钝加,最好先把下面出口关闭,让液体不活动,上完样品后再打开下口,这样可以担保上样较量匀称,当胶平面没有液体的时候再用你的均衡液体按上样的要领加就可以,然后再打开下口,千万别让液体流干,也不能把胶平面冲坏.收集的时候可以按5m可能10ml一管,时间是按照你柱子的流速.

82) 请问哪里有关于免疫组化S-P法详细操纵步调的资料?
SP免疫组化法,全称链霉菌抗生素卵白-过氧化酶毗连法。你购置的哪家试剂盒都有很具体的要领,可能你上一些提供试剂盒的公司网站接洽他们都可以获得具体的质料.
下面的文献你可以看看.


83) 师兄你好,
我有一个问题想请教,在以前的贴子中没有看到。我要做抗体的真核表达,为排泄表达,表达出来的卵白没有标签,因为但愿尽大概保持抗体的布局,因此不能用那些针对组氨酸等标签的的柱子,我的抗体是个融合卵白,约莫是IgG的三分之二巨细,是sCFv和CH3毗连而成二硫键毗连的双链,没有CH2区,我看proteinA和proteinG柱子都是要团结FC,那我的卵白FC不完全的话还能用吗?要不我怎么办啊?尚有,对付没有标签的抗体是不是无法和细胞造就利用的小牛血清中存在的抗体样物质分隔呀?是不是必需要无血请造就。我的确不知道该怎么设计尝试啦。感谢。
你好,我看的书上说CH3是FC受体的团结区,而C H2是补体团结区,这说明卵白A和卵白G应该是和CH3团结的,你可以表达出来用卵白A或G的试试,另外抗体有很好的疏水性,用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片断,包罗单链抗体,至于血清中的抗体,它们和亲和柱子以及疏水等的微小不同通过改变洗脱条件获得纯化,虽然你可以用无抗体的血清造就或无血清造就,我以为你照旧选表达出来再说了,而血清中的白卵白很容易用染料亲和的要领就可以去除。

84) chromatography,您好!我此刻用的Ni-NTA举办亲和纯化一个约45KD的卵白,关于菌体的破碎,有人推荐用溶菌酶,有人说超声波,我用溶菌酶试过一次,但12000*20min离心后,上清中没有目标卵白,你能不能将相关的质料也发给我一份
用超声破碎的较量多,假如你有设备的话这样破碎较量好,因为时间短,破碎结果也好,而溶菌酶不完全,并且不大好操纵,我不怎么做上游,不很清楚,你可以再仔细问问别人有关破碎的问题,纯化的质料我给你发一份,但愿对你有所辅佐.

85) 假如裂解液中加了一些卵白酶抑制剂,纯化时要不要思量尽大概最后去掉这些卵白酶抑制剂?
一般添加的都是小分子的物质,并且也不会和方针卵白团结,纯化进程一般就去除了,所以不消出格思量去除的问题.

86) 选择sephadex G75可能superdex 75,柱子的巨细一般都是按你的处理惩罚量算的,凡是的柱子大多是1.6x60,2.6x60,可能有100cm的柱子,内径为1.6可能2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
1,我们尝试室没有sephadex G75(3000-80000),最靠近的就是sephadex G100(4000-160000),并且都是80年月的产物,如何判定还能不能用?网上可以找到这两种填料的说明书吗?
2,您所说的处理惩罚量指的是样品的质量(mg)照旧上样的体积(ml)?就我所知有两种计较要领。其一是按照质量算:卵白质技妙手册(汪家政)上说有一种工式:柱直径=(m/10cm)1/3个中m是卵白的质量(mg),柱的长度=柱直径*30,但这个柱直径 的计较公式我没看大白,用不上;其二是按照上样体积算:假如上样量是1ml,按1%的柱床体积则需要100ml树脂,直径1.5-1.6,长度50-60,但假如按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂,这样柱参数的变革又极大。您凡是是奈何计较的?(详细到我所要疏散的卵白上样量是1ml,包括杂卵白的总质量是4mg)
3.100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?

1.G100刚性欠好,容易因为压力,盐变革而体积改变,实在没有步伐也只能用这个,可是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才气担保有很好的疏散结果,说明书我想欠好找,可是它和所有的sephadex处理惩罚是一样的。
2,处理惩罚量对付凝胶过滤一般是按体积算,凡是上样量是柱床体积的5%阁下应该,假如很靠近,也可以低落到2%,你的1ml样,1.6x60cm的足够了。
3。一般稀释至少在2以上。
87) 尚有个小问题,是不是G后头的数字越大,就刚性越差,越容易受外因素影响?
是的,G后头的数字越大,就刚性越差,越不耐压和盐溶液。

88) 我表达的是带有GST的融合卵白,醇化后需用凝血酶切割,我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?
是一样的,可是用于酶切的要求的纯度更高。

89) 在做WB,因为是血清标本,含有较多的白卵白,大概影响我的尝试功效。我请问过ptglab楼主,他推荐我来这儿问一问。请问好手有什么要领吗?哪一种较量简朴经济?蓝色琼脂糖凝胶可以疏散吗?
用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除,我以为很快也很特异,样品直接穿过柱子白卵白就可以去掉90%以上,你pM你的邮件地点给我,我给你一份相关的质料,我们这里就有这个填料。

90) 凝胶过滤层析、离子互换层析、亲和层析上样时,对样品目标卵白浓度的要求是不是一样的?样品浓度一般要求在多大范畴内?
凝胶过滤处理惩罚样品量主要是受体积的影响大,浓度相对要小一些,上样量在床体积5%阁下,假如是除盐可以上到20%阁下。
其他的主要是上样的浓度,一般就在5-10mg/ml填料,详细的环境得看填料的载量和利用说明。

91) 我问的意思 是在纯化进程中,假如卵白酶抑制剂去掉了,而该卵白酶还未去掉,我担忧此卵白酶还会消化我的目标卵白,请问我说得有没有原理?有没有须要思量?
你可以用抗体做WB检测你的纯化的卵白,假如确实有酶解的现象,那你可以在纯化进程中你的缓冲液里加一些抑制剂,然后再做比拟,我以为你思量得很周到,这个也是值得留意的问题,可是纯化的进程时间不长,一般没有须要这么做,可是有的卵白有降解的现象,那就加试试。

92) 离子互换层析、亲和层析上样时样品的卵白浓度可以到达5-10mg/ml?我以为浓度是不是太大?

歉仄,没有说清楚,我的意思是填料的载量大多在这个范畴,所以上样的几多由填料对你的方针卵白的载量有关,也和填料的性质有关,一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上,至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么干系,因为个中真正你的方针卵白不必然很高,所以其实这样的浓度也没有干系,详细的量和浓度照旧要颠末尝试才知道。

93) 破碎菌体,加pBS缓冲液,方针卵白就可以容于pBS缓冲液了吗?我的卵白是包容体。

那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包容体,然后复性再纯化了,用普通的缓冲液是溶解不了你的方针卵白的,你的卵白再破碎后的沉淀里,不在上清中。

94) 你好,我最近做纯化,赶上了两个问题,第一是利用sephrose fast flow做初纯,因为胶不足,我就将一年前利用过的旧胶(放在冰箱里)插手在正在利用的胶内里,呈现了怪现象,整个胶酿成了絮状, 沉不实,我一看,旧胶内里是有许多絮状物(不是其它对象,也是胶)漂在上面,下面沉淀的是胶,我当即插手了2M的NaCL,这时分层了,絮状物在上面,下面是胶,我于是撤除了上面的对象,把下面的胶加上水清洗了三次,又用pH5.0的NaAC
处理惩罚了三次,完了,又变回当初的絮状态了,象不变的絮状胶体一样,真不知到底怎么回事(也就是说加盐它就能沉,加水就絮状胶体),我的胶是不是不能用了?
别的,我做亲和,目标卵白下面有两条带怎么都去不掉,我的卵白是4聚体,是不是做SDS-page将它 解离了?我规划做native看看,可是高效液相功效显示很纯的,只是主峰后头有个雷同拖尾的小峰,不知道是不是没有分分开,想请你帮我指点一二,别的能不能先容下亲和方面的资料,很是感激
你的旧填料是怎么生存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,假如欠好,那就没有步伐了,可是一般这么处理惩罚应该没有问题.
亲和你用的是什么要领呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我以为你得先说清楚这样才好阐明.

95) chromatography兄,很感激你的辅佐,我这里没有抽滤漏斗,请问哪里可以买?贵吗? 我来日诰日用你说得步伐处理惩罚屡次,看看有没有步伐办理,假如没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?
亲和我利用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,配合存在时才有活性,那两条杂卵白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱回收底物雷同物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉个中的一条杂卵白,可是别的较小的那条根基很难去除,有杂卵白存在时酶活往往低落的好快,请chromatography兄帮我阐明阐明原因,很谢谢.
这样的砂心漏斗试剂公司就有,不贵,一套也就300来元,没有抽滤还没有此外好取代了,也可以用中间夹膜的漏斗。
至于你说的两条带,那按理你用底物雷同物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢,你均衡用什么条件,洗脱呢,你用什么活化的填料,我以为非特异吸附的环境是存在的,你可以改变洗脱的方法,凡是这些非特异吸附是离子互换浸染,你可以可以在均衡液里增加点盐,这样可以去除这样的吸附,另外你方针卵白会不会降解,这样有小分子还一样被吸附,你可以通过抗体做WB看看,假如是这样,那只能在纯化进程中加一些酶的抑制剂来制止。
我能想到的就是这两种环境了。

我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的,然后插手偶联剂留宿,最后插手配基,回收pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液均衡,洗脱是等PH条件下举办的,只不外改变了洗脱剂的浓度,从最大浓度洗脱的功效看,往往就少了个中一条带,你的表明我会当真思考的,亲和中存在离子吸附,是不是方针卵白和杂卵白的等电点很靠近造成的?均衡液中加点盐,主要起什么浸染?一般加几多?利用什么盐好那?假如是我的卵白解离,这样的杂卵白有没有什么此外要领洗掉(除了加酶的抑制剂)?

你其实照旧没有说清楚你活化的要领,看你的意思好象是环氧活化的要领,不知道你是怎么偶联的,假如你以为是奥秘,那也没有干系,只是你不说我很难判定是不是有非特异吸附,总之要是氨基和羧基缩合的要领,不免有离子互换浸染,溴化氰也是这样的,而假如是环氧活化的要领,那么就没有离子互换的非特异吸附,至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了,假如是因为降解,那也许用这样亲和的要领就得把条件摸更细致点,假如不可,那可以看凝胶过滤能不能分隔,纵然不是降解,你也可以思量凝胶过滤,而从你反应的环境好象杂质是个酶,加点抑制剂看看吧。

真的感谢你无私辅佐,我来到这个公司之前,他们就 已经利用这种要领了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的,然后插手偶联剂留宿,最后插手配基』,我也不知道为什么,和经典的环氧等要领纷歧样,我们偶联剂用的是10个C,培基是带氨基的,硼氢化钠应该是还原剂的,基质是sepharose cl-6B,详细对这方面我不是很相识。我想最近作个native,和SDS比较一下,看看是不是降解,另外,这两条杂带从离子互换的时候它就一直存在的。
我就把胶放在柱子里,加上碱洗了三次,上面的水直接吸走,然后水洗,在加浓盐洗了两次,上面就漂浮着一层悬浮物,我小心再把它从上面吸走,之后在水内里仿佛就很好了,显微镜下我仔细看,与新胶没什么区别,感谢你的辅佐哦,我只是没有砂心漏斗,没举措试试罢了。活化的要领是什么?我本身都不清楚.

96) 1、我们用CM52大量纯化某卵白,常常会遇到介质缝隙,不知什么原因?
2、离子互换层析时柱高/直径的值有很高要求吗?假如为5/7会对疏散有很大影响吗?用PB或ABS均衡时你们一般用几多柱床体积?
3、我们用5KD超滤浓缩后卵白的损失很大,可否资助阐明一下原因(PALL 的超滤器)?

那也许是因为有气泡,累积到必然境地后就穿过介质所以缝隙,你流速不能太快,并且缓冲液脱气,这样就应该好了.
2.一般离子互换没有须要算什么高/直径比,一般用的短粗柱子,亲和和疏水也都是这样的就可以,没有决心要求,5/7应该影响也不大,虽然假如你走线形梯度洗脱,也适当把这个比值增加点,假如走阶段洗脱就没有干系。
3。超滤膜自己的面积不小,这样也会吸附卵白,出格是处理惩罚的量较量小的环境损失会很明明,假如量大,那损失会小的,另外假如卵白不耐剪切力,那么用这样的要领浓缩也要出格小心,因为失活会很明明的。

97) 我做的是原核表达卵白质,目标卵白是一个GST-融合卵白,此刻通过SDS-PAGE电泳发明目标条带已经表达出来了,正在做纯化,可是过柱纯化后发明尚有其他的几条带,应该只有目标条带的,我就凭据分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发明杂带尚有几条,但目标条带却不见了,
1.为什么目标条带不见了?
2、下一步应该怎么办呢?
假如你的有一些此外杂带,那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积,另外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱,你试试,另外加大上样的流速,缩短浸染时间,在你的均衡缓冲液中加点盐淘汰非特异吸附,你的带不见了,大概是
triton-100滋扰团结,所以不能用,你用吐温也试试看,因为这个纯化特异性是较量高的,除非你的卵白有降解现象,你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的方针卵白,总之修改的方案就是我说的这几个,探索一下吧。
另外可以选择浸染力更弱点的填料。这样特意性更好。

98) 手头有碱性磷酸酶的资料吗?可否汇报我它的具体布局 我想提纯 感谢拉
最好还可以汇报我想关的提纯要领!它存在于细胞壁与膜之间,或许80K(四聚体)、32KD(二聚体),它耐高温80度仍然保持活性(在有镁离子存在的环境下),最适PH8.0
我此刻已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么质料填柱
卵白没有什么具体的布局吧,至于纯化它既然是碱性的卵白,那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化,另外既然它能耐受80度,那你这样处理惩罚,大多的杂卵白就沉淀了被去除,再上离子互换就应该有不错的结果。
填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。

99) 前几天我提取了一种菊科植物的卵白,用的是tris—Hcl缓冲液,然后用100%丙酮沉淀卵白,功效卵白中含有色素杂质,属水溶性,颜色很深,请教好手,如何撤除色素滋扰,纯化卵白?别的我也查了一些资料,说大概是花色素,于是我在100%丙酮沉淀后,加了一步0.1%甲醇,可是并没有显著的结果。
你说的花色素就是黄酮类的花青素吗,它有很强的亲水性,所以丙酮沉淀它也沉淀,你可以改用乙醇沉淀可能硫酸铵沉淀,这样色素就不会被沉淀了,你试试吧。

100) 用PB(pH6.8)或ABS(pH4.0)均衡时你们一般用几多柱床体积?10X够了吗?
一般也就3-5个床体积吧,离子互换需要均衡体积大点也,10X足够了

101) 有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教,我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%,进一步纯化,用什么柱子,详细操纵又奈何做呢,感谢见教。
我知道,我好象回覆过,你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm可能2.2X25cm的柱子做制备,这样可以到达99%以上的纯度,此外要领很难做到你需要的纯度,另外胰岛素也可以用等电点沉淀的步伐去掉一些杂质。

HPLC制备你可以参考相关的文献,其实也就是甲醇水可能乙腈水含三氟乙酸,先是低浓度吸附,然后提高浓度洗脱,具体的条件和你做反相纯化是一样的,只是HPLC的疏散结果更好。
102) 请问奈何可以查到protein的PI值?,多谢了先!
已知的卵白虽然是查资料,未知的假如知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.
103) 谢了chromatography兄,也就是必须用小颗粒的硅胶填料了。
是的,需要用HPLC做制备,可能你优化的你工艺,看能不能提高纯度.

104) chromatography兄:
很是感激回覆,我手里也有一个GST融合表达的项目,经纯化后,用EK酶切时,出问题了。
目标卵白是12KD阁下,PI约PH9.5。用PH8.0,0.1M NACL条件酶切时,回响液发混,全部沉淀,切出的卵白(约12KD)经尿素溶解,透析后,PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0,2mM CaCl2条件酶切时,也有发混,但目标卵白有14KD阁下,PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题?
别的,chromatography兄,有化学破菌及EK酶切相关文献吗?给我发一份好吗,E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn
别客套,有沉淀也许是卵白在那样的pH下溶解度欠好,可能因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的结果如何.
至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的对象:
~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins

105) 我想用DEAE纤维素来做填料
我的粗提酶液卵白含量约莫为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢?

DEAE纤维素要是同一家公司的不同不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我以为你照旧选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么须要必然用纤维素,况且价值也不自制.你做的是什么酶呢.


106) 我想请问一下您在装柱(尤其是分子筛柱子)是否是凭据填料的说明正向装呢,照旧反向装?
我两种要领都试过的,可是只有一次是正向装完后,检测效价为30,000。请问装柱进程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外,尚有没有其他要留意的。最好能给我一个Protocol。感谢!
别的,尚有一个问题,我有一个90kD的融合卵白(连GST),用GST的亲和柱纯化后老是有50多kD和20阁下的杂卵白。我用Sephacryl-S100能去掉它们吗?可能您可以给我一个更好的发起
1,我不大白,虽然是正向装了,反向怎么装呢,其实装柱子只要匀称就可以,我险些没测定过柱效,也没有Protocol,因为一般装的都没有问题,只要留意你说的几个问题就可以。
2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢,你可以优化你纯化的条件,在均衡液体中提高盐的浓度,这样可以低落非特异吸附,这样再做做看,另外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么功效,我以为你先优化完假如没有纯化好,再用凝胶过滤吧,你可以选择sephadex G75可能是Superdex G-75,这样你的方针卵白在外水体积中出来,后头的杂质在内水体积中,这样结果会更好点,假如用前面的S100不会比后头的两个填料结果好的。
107)
108) chromatography 年迈
我做的是碱性磷酸酶,约莫32KD,我此刻只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,(好比质料的选择原则、洗脱液的选择、操纵等方面)

这个卵白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子互换的柱子,这样纯化不知道能到几多纯度,另外可以用亲和的步伐,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,譬喻对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是较量好的要领.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,另外把我见到亲和的文献发给你一篇

chromatography 年迈, 感谢你拉, 资料我收到了, 我先看看尚有问题在找你资助了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶, 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化 是什么名目标我这解压缩后打不开了
文件是zip名目标,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的.

109) chromatography 辛苦
我想纯化碱性卵白酶, 详细要领设计如下:
65%硫酸胺沉淀,透析袋.
可是我的卵白酶卵白含量不损失是严重,不知道尚有什么好的要领浓缩.
下一步纯化要领DEAE50, G200两种填料
不知道留意什么?感谢
别客套,我不太清楚你说的可是我的卵白酶卵白含量不损失是严重,是什么意思,是损失严重吗,按理透

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